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MicroRNA-141在结直肠癌的作用及医学机制研究

日期:2018-12-27 21:56 作者:绮为论文网 论文字数:4169 点击次数:0
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本文是一篇医学论文,中、西医学在张仲景和盖伦完全相悖的医学范式引导下,开始步入了分道扬镳的历史进程。在中华文化强调“中和”的大背景下,学术界便有了“海纳百川”的宽

本文是一篇医学论文,中、西医学在张仲景和盖伦完全相悖的医学范式引导下,开始步入了分道扬镳的历史进程。在中华文化强调“中和”的大背景下,学术界便有了“海纳百川”的宽松气氛。(以上内容来自百度百科)今天为大家推荐一篇医学论文,供大家参考。
 
第 1 章 绪 论
 
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是发生在直肠或结肠的恶性肿瘤之一,已经成为了当前全球范围内最常见的消化系统恶性肿瘤[1]。流行病学的统计数据证实,中国人群结直肠癌发病率和致死率已分别位居恶性肿瘤的第三位和第五位,并呈现出快速上升的趋势[2];而在美国,新增结直肠癌患者数以及致死数均已位居恶性肿瘤的第三位[3],已经成了不容忽视的健康问题。目前对于结直肠癌的治疗方案以手术切除为主并根据病情结合化疗,CRC 早期患者的五年生存率能达到 90%左右,但中晚期患者或发生其他器官转移的患者的生存率仅仅只有15%左右[4]。因此,CRC 的早期诊断和干预治疗对于提高生存率具有重要的价值。近年来,随着基因生物学等技术手段的长足进步,对结直肠癌的机制研究也出现了深刻的进展,毫无疑问,结直肠癌的发生与发展受到多种复杂基因机制的调节调控,其中微小 RNA(microRNA,miRNA)在结直肠癌中的作用地位日益受到医学研究者们的关注。miRNA 是一类长度约为 22 个核苷酸的非编码单链小分子 RNA,已经证实 miRNA 广泛存在于各种真核生物细胞内,能完全或部分与其靶基因的 mRNA 分子的 3’端非编码区域(3-untranslated region,3'UTR)发生碱基的配对,从而诱导靶基因 mRNA 发生降解,最终抑制靶基因转录为蛋白质的进程[5]。miRNA 早在 1993 年在秀丽杆线虫幼虫体内第一次证实了 miRNA 的存在,并且很快引起了研究者的广泛兴趣,大量针对 miRNA 功能作用的研究已经开展并且取得了显著的成果[6]。我们通过检索 microRNA 癌症协会数据库(microRNA Cancer Association Database),发现截止 2017 年 12 月份,仅在PubMed 数据库中收录的、与人类结直肠癌相关的 miRNA 的文献数量已经超过500 篇,涉及 miRNA 数量大约 180 多种,研究成果与结直肠癌的早期诊断和发病机制及治疗应用等多个方面相关。因此,为了进一步揭示 miRNA 在人结直肠癌中的作用,本文通过对 miRNA 的生物合成、结构和基因调节功能等方面进行了全面的综述,总结已有研究对 miRNA 在结直肠癌中的作用和机制的相关研究,为结直肠癌的早期诊断及其治疗提供理论依据。
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1 miRNA 的生物结构
miRNA 是由基因组中非编码基因转录而来的,属于一类长度约为 22 个核苷酸的内源性非编码单链 RNA。miRNA 在进化上高度保守,家族种类繁多,当前研究者们已经在脊椎动物的基因组中检测到超过 1000 种各类型的 miRNA,其可能参与调控了人类大约 1/3 甚至更高比例的基因表达和蛋白功能调控。miRNA 的生物合成过程主要分为两个程序[7],首先是编码 miRNA 的基因在RNA 聚合酶的作用下,转录得到 pri-miRNA 后经 Drosha 酶剪切,形成pre-miRNA,即发夹状前体 miRNA。pre-miRNA 通常长度约为 70-100nt,受到miRNA 转运蛋白(Exportin-5)和 GTP 酶的协同作用,从细胞核中转移到细胞质中,并再次被细胞质中的 Dicer 酶-1 进一步加工和剪切,生成了长度约为20-25nt 的双链螺旋 miRNA,即为成熟态 miRNA。该双链 miRNA 被解开螺旋之后,其中一条会在酶的作用发生降解,而另外一条单链状态的 miRNA 会在细胞质中的 RNA 诱导沉默复合物(RISC)的作用下,通过与靶基因 mRNA 的 3’端的互补位点发生完全或者不完全的碱基配对,导致靶基因 mRNA 的降解,最终抑制靶基因 mRNA 的蛋白翻译过程。除了经典的依赖 Drosha 酶的合成途径外,最近的研究也发现,真核细胞内也存在另外的不依赖 Drosha 酶的 miRNA 合成途径,例如,Argonaute2(Ago2)蛋白也具有催化 miRNA 合成以及相关调节 miRNA功能的作用,主要表现为当 miRNA 和靶基因的碱基序列配对比例高的时候,RISC 切割酶的 Ago 作用会导致靶基因在互补序列的碱基发生特异性断裂[8]。
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2 miRNA 在恶性肿瘤中的作用及相关机制
1993 年,研究者们在秀丽隐杆线虫的幼虫体内发现了 miRNA 的存在,并且很快引起了研究者的广泛兴趣,目前已有大量研究揭示了多种不同 miRNA 的不同生物功能,其中与肿瘤发生发展、诊断治疗相关的 miRNA 数量已经超过了 600种。miRNA 本身是非编码 RNA 分子,并不能直接参与蛋白的转录翻译,但其通过与靶基因 mRNA 的发生完全或不完全结合的碱基配对,从而调控靶基因的蛋白表达水平。在正常生理状态下,miRNA 能够参与维持细胞内基因表达调控机制,是细胞功能正常的重要参与者;而在病理因素等的刺激下,如正常细胞发生癌变,其中 miRNA 的表达水平也发生了显著改变,出现了异常的增强或抑制,也是肿瘤发生发展进程的关键调控因子之一[9-11]。
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2.1 miRNA 与癌细胞增殖和凋亡
根据 miRNA 在肿瘤细胞的增殖和凋亡中的作用,可以将其初步分为原癌基因或者抑癌基因。原癌基因具有抑制癌细胞凋亡或者促进其增殖的作用,BreunigC 等人研究发现,具有原癌基因作用的 miRNA-519a-3p 能靶向结合乳腺癌细胞表面的 TRAIL 和 FasL 受体,从而调控凋亡抵抗信号的转导,从而发挥原癌基因的作用[12]。类似的,国内研究人员 Tu K 等人也证实,miRNA-519a-3p 在肝癌细胞中出现异常表达升高,并且能够靶向 PTEN/PI3K/AKT 信号通路增强肿瘤细胞的增殖水平[13]。此外,miR-224 也是典型的原癌基因功能的 miRNA,在胃癌组织中 miR-224 的表达增强,通过抑制 Fas 蛋白的表达,从而进一步下调了 Caspase蛋白家族的表达水平,最终对胃癌细胞的凋亡起到了抑制作用[14]。而与之相对的,抑癌功能的 miRNA 是一类能够发挥抑制癌细胞增殖或促进其凋亡的 miRNA,其作用机制往往是通过调控凋亡相关通路和蛋白的表达来实现,例如,Acunzo M的研究表明,白血病患者体内的 miR-15a 和 miR-16 含量出现降低,而这两种miRNA 属于抑癌 miRNA,其作用机制是能够靶向 Bcl-2 基因的 3’非编码区结合,从而抑制 Bcl-2 基因转录,增强肿瘤细胞的程序性凋亡,因此 miR-15a 和 miR-16的表达异常可能是白血病发生发展的重要调控因素[15]。
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第 3 章 miR-141 对人结直肠癌细胞HT29 生物学行为的作用..........19
3.1 实验材料 ......19
3.1.1 实验试剂 ........19
3.1.2 实验仪器 ........20
3.2 实验方法 ......21
3.3 实验结果 ......28
3.3.1 重组质粒的转染效率 ......28
3.3.2 重组过表达质粒对 HT29 细胞中 miRNA-141 表达水平的作用......29
3.3.3 miR-141 过表达对 HT29 细胞增殖的作用........29
3.3.4 miR-141 过表达对 HT29 细胞迁移能力的影响.........31
3.3.5 miR-141 过表达对 HT29 细胞侵袭能力的影响.........32
3.3.6 miR-141 过表达对 HT29 细胞凋亡的影响........33
3.4 讨论 .....34
3.5 小结 .....36
第 4 章 miR-141 下游靶基因的预测及验证 ...........37
4.1 实验材料 ......37
4.1.1 实验试剂 ........37
4.1.2 实验仪器 ........39
4.2 实验方法 ......39
4.3 结果 .....50
4.4 讨论 .....53
4.5 小结 .....55
第5章 ZEB1在miR-141抑制结直肠癌细胞生物学行为中的作用及机制 .........57
5.1 实验材料 ......57
5.1.1 实验试剂 ........57
5.1.2 实验仪器 ........59
5.2 实验方法 ......59
5.3 结果 .....69
 
第 5 章 ZEB1 在 miR-141 抑制结直肠癌细胞生物学行为中的作用及机制
 
ZEB(zinc finger E-box-binding protein)蛋白家族是指 E 盒结合锌指蛋白,包括 ZEB1 和 ZEB2 两种亚型。目前研究证实,ZEB1 是调控肿瘤细胞 EMT 的关键转录因子之一,已被证实在多种恶性肿瘤细胞的表达是异常增加的,是诱导肿瘤细胞侵袭转移的调控因子。ZEB1 蛋白的锌指结构端能够与 E-cadherin 编码基因的启动子区域的 E-box 结构发生特异性结合,从而抑制 E-cadherin 蛋白的表达,最终能够抑制肿瘤细胞的侵袭和转移[96]。另一方面,也有研究指出,多种miRNA 能够调控 ZEB1 蛋白,从而能与含有与 C 端结合蛋白的编码基因发生相互作用,从而抑制肿瘤细胞的 EMT 进程[97,98]。但是迄今为止,关于 miRNA调控下的 ZEB1/E-cadherin 信号轴在结直肠癌 EMT 中的研究甚少,因此,我们在本部分的研究中,采用了 siRNA 干扰技术,继续探索 ZEB1/E-cadherin 在miRNA-141 调控结直肠癌细胞生物学行为中的作用和机制。
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结论
 
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