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fyuA+大肠埃希氏菌靶标抗菌肽的设计及其医学作用机制

日期:2019-01-16 22:46 作者:绮为论文网 论文字数:3798 点击次数:0
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本文是一篇医学论文,世界上医学主要有西方微观西医学和东方宏观中医学两大系统体系。医学的科学性在于应用基础医学的理论不断完善和实践的验证,例如生化、生理、微生物学、

本文是一篇医学论文,世界上医学主要有西方微观西医学和东方宏观中医学两大系统体系。医学的科学性在于应用基础医学的理论不断完善和实践的验证,例如生化、生理、微生物学、解剖、病理学、药理学、统计学、流行病学,中医学及中医技能等,来治疗疾病与促进健康。(以上内容来自百度百科)今天为大家推荐一篇医学论文,供大家参考。
 
前 言
 
细菌对抗生素耐药性的出现,对人类健康造成了巨大的威胁,重新燃起了人们对抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)研究的兴趣。抗菌肽是先天性免疫系统的重要组成部分,由于其是多细胞生物产生的保护机体免受病原微生物侵害的成分,所以也叫宿主防御肽。抗菌肽一般含有少于 50 个氨基酸残基,具有阳离子性和两亲性。抗菌肽对各种各样的病原微生物均表现出了广谱的抗微生物活性,包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌、病毒,很多抗菌肽对多重耐药菌也有一定的作用。此外,抗菌肽热稳定性较好,无致畸变作用,无蓄积毒性,不易诱导耐药菌株的产生,因此,抗菌肽有望成为新一代抗菌制剂。在人类粘膜表面存在的正常菌群,对机体营养吸收和保护机体抵抗外来微生物起着重要作用。由于 AMPs 的广谱抗菌作用,会毫无选择地杀灭正常菌群。正常菌群的破坏会引起耐药菌株的出现,因此靶向抗菌肽应运而生,它可以选择性地杀灭致病菌而对正常菌群无作用或者作用很小,从而保持机体正常菌群的生态平衡。近年来有研究揭示了来自鼠疫耶尔森氏菌(Yersinis pestis)的一种蛋白毒素,——鼠疫菌素(Pesticin,Pst)的晶体结构 。发现它由两个结构域组成—结合域和杀伤域,结合域可以与 FyuA 特异性结合,发挥靶向性作用。FyuA 是一种完整的外膜蛋白,可以作为 Pst 的受体,它也是一些耶尔森菌、致病性大肠杆菌的主要毒力因子。
特异性靶向抗菌肽(Specifically targeted antimicrobial peptide,STAMP)技术是一种特异性靶向抗菌肽的设计方法,通过连接两个功能性独立组份,构建一种新的肽类抗生素,也就是说,一个靶向区域和一个抗菌肽杀伤区域,由一个短的柔性连接子连接。通过结合病原体的特异部位,靶向区域赋予杀伤区域选择性,使杀伤区域发挥特异性杀灭作用,因此,STAMP 技术是一个从正常菌群中特异性根除病原菌的有效途径。大肠杆菌表达系统是目前在基因工程领域中研究最多、最完善的原核表达系统。由于其生长快速、更大的商业载体的时效性、已经被很好建立的 DNA 处理流程、关于它的遗传学、生物化学和生理学广泛的认知,大肠杆菌被认为是最有效的生产融合蛋白的方法。概括起来说,大肠杆菌仍然是生产 AMP 的第一宿主菌选择,也是目前被报道的产率最高的一种方式。然而,在细菌中表达抗菌肽方面,为了达到更有效的产率,仍然存在着许多需要克服的挑战。第一是阻止抗菌肽的天然活性对宿主菌的毒性问题。由于抗菌肽的毒性,使宿主菌生长缓慢,导致菌体破碎甚至死亡。第二个存在的问题是,克服表达的抗菌肽由于其化学特性和分子量小致使稳定性差和不易纯化鉴定的问题。另外,AMP 已经是一些宿主菌合成的蛋白酶的靶标。因此,需要将抗菌肽和一些载体蛋白融合表达的方式,来避免其对宿主菌的毒性,提高抗菌肽的稳定性。因此,本研究以实验室前期从牛蛙分离的抗菌肽catesbeianin-1为研究对象,将其通过柔性连接子与来自 Pst 的 FyuA 靶向区域连接,设计了 4 个改良肽,并在大肠杆菌表达系统中与 SUMO 融合表达。通过测定改良肽的最小抑菌浓度、最小杀菌浓度、时间动态杀菌曲线、溶血率以及靶向作用,筛选出了一个活性高、毒性小、靶向作用强的抗菌肽 BD-catesbeianin-1,并研究了其对大肠杆菌细胞膜的作用机制。通过利用 BD-catesbeianin-1 对 20 株大肠杆菌临床分离株的抗菌试验结果证明,该靶向肽可选择性与携带 fyuA 基因的大肠杆菌结合,并对其呈现杀菌效应,同时,BD-catesbeianin-1 对感染大肠杆菌的小鼠也表现出了较好的治疗效果,为其在实践中应用提供了理论基础。
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第一篇 文献综述
 
第一章 抗菌肽的分子设计研究进展
虽然抗菌肽可以作为抗生素的替代品,但是开发其成为安全药物还存在很多问题。比如抗菌肽的溶血性。阳离子抗菌肽偏好带负电的细菌细胞膜,但它们在高浓度下会损伤哺乳动物细胞[1]。在生理条件下,抗菌肽需要较高的浓度才能发挥作用,因为生理盐浓度和血清成分会抑制抗菌活性,导致宿主细胞溶血[2]。另外,抗菌肽虽然不会像抗生素那样产生耐药性,但是有的抗菌肽活性并不强,因此,提高抗菌肽的活性和最大程度的降低其毒性成为抗菌肽分子设计的主要目的。这一章,我们综述了抗菌肽的分子设计的研究进展和它们作为安全抗生素的潜力。由于抗生素抗性问题日益增多,目前对新的治疗方法,包括抗微生物肽(AMP)(1-3)有很多兴趣。AMP 是先天免疫系统的关键组份,包含 10-40 个氨基酸,通常带净正电荷,并含有较多的疏水残基。尽管 AMP 在细菌中诱导多种损伤,包括抑制 DNA,RNA 和蛋白质合成,但它们的主要作用模式是破坏细菌膜。已经提出了抗菌肽的几种作用机制,包括“桶板”模型、“环孔”模型等。化学势梯度可能是由于肽通过膜的移位而引起瞬时缺陷造成。此外,由于肽结合引起的膜侧向扩张而允许烷基链的松弛并导致膜变薄,进一步导致膜的不稳定性增加。肽诱导的脂质分离和/或相变也可能导致肽诱导的膜破裂。AMP 的治疗应用的关键是它是选择性的、有效地破坏细菌和其他病原体,但对人类细胞膜造成有限的损伤。然而,通过分析筛选肽的性质,这种选择性可能通过细菌和人细胞膜之间的组成差异实现。因此,人类细胞膜富含胆固醇(20-50mol%),而真菌膜含有麦角甾醇,细菌根本不含甾醇。磷脂组成也有差异。例如,红细胞膜的外叶主要是两性离子脂质,包括鞘磷脂和磷脂酰胆碱,使其基本上不带电荷,而细菌细胞膜富含阴离子脂质。这种组成差异导致了肽结合和膜不稳定性的差异。
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1.2 抗菌肽的分子设计原则
 
1.2.1 两亲性和阳离子性原则
虽然抗菌肽结构和序列具有多样性,然而其分子设计的最主要原则为两亲性和阳离子性。两亲性是抗菌肽能否有效插入细胞膜内部从而形成疏水通道的决定因素。阳离子性与其抗菌机制相关。由于细菌细胞膜呈负电荷,因此,阳离子性的抗菌肽更易于结合在细胞膜表面并通过细胞膜,而不与不带电荷的真核生物细胞膜产生作用。这也是抗菌肽对哺乳动物细胞作用较弱甚至没有毒害作用的原因[6]。另外,不同 pH 条件下,氨基酸会带不同的电荷,比如在酸性或中性条件下,Lys 和 Arg 都带有正电荷,因此含有 Lys 和 Arg 的抗菌肽受 pH 变化影响小;而含 His 的抗菌肽受 pH 的影响比较大。所以,增加抗菌肽中正电氨基酸残基的数目,或者改变它在肽链中的排列位置,都可以影响抗菌肽的二级结构,进而影响抗菌肽的活性。
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第三章 fyuA+大肠埃希氏菌靶标抗菌肽的筛选及评价........57
1 材料.......57
2 方法.......58
3 结果.......62
4 讨论.......69
5 小结.......71
第四章 fyuA+大肠埃希氏菌靶标抗菌肽的作用机制研究....73
1 材料.......73
2 方法.......75
3 结果.......79
4 讨论.......83
5 小结.......85
第五章 BD-catesbeianin-1 对感染大肠杆菌小鼠的治疗......87
1 材料.......87
2 方法.......88
3 结果.......90
4 讨论.......96
5 小结.......98
 
3 结果
 
3.1 BD-catesbeianin-1 对小鼠的半数致死量(LD50)结果
3.1.1 BD-catesbeianin-1 对小鼠半数致死量的预实验结果
catesbeianin-1 和 BD-catesbeianin-1 组小鼠的注射剂量与存活情况如表 5.1 所示,由表中数据确定 catesbeianin-1 和 BD-catesbeianin-1 对小鼠 LD50的合适浓度范围均为 36 mg/kg-100 mg/kg。预实验中,各组小鼠的接种浓度和死亡情况如表 5.5 所示,由结果可知,引起小鼠 0%和 100%死亡的浓度分别为 9.6×106CFU/mL 和 1.54×108CFU/mL,因此,以此作为正式实验的浓度范围,设置不同的浓度组,记录各组小鼠的死亡情况,利用 Bliss 算法计算 E.coli 对小鼠的半数致死量(LD50)为 2.146×107CFU/mL。
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结 论
 
1. 根据母本肽 catesbeianin-1 的生物信息学分析结果,利用鼠疫菌素的 FyuA外膜蛋白靶向区域,由柔性连接子与母本肽连接,设计得到了 4 个拟靶向 FyuA的 改 良 肽 : BD-catesbeianin-1 、 T-catesbeianin-1 、 T1-catesbeianin-1 以 及T2-catesbeianin-1。
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